The development and prevalidation of an in vitro mutagenicity assay based on MutaMouse primary hepatocytes, Part I: Isolation, structural, genetic, and biochemical characterization

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dc.contributor.author

Cox, Julie A.

Zwart, Edwin P.

Luijten, Mirjam

White, Paul A.

dc.date.accessioned

2024-03-28T20:26:00Z

dc.date.available

2024-03-28T20:26:00Z

dc.date.issued

2018-12-27

dc.description - en

Health Canada is responsible for evaluating the safety of chemicals in commerce; all evaluations include an assessment of a substance’s ability to damage genetic material (i.e., genetic toxicity). Genetic toxicity tests using cultured cells (i.e., in vitro tests) provide a cost- and time-effective alternative to more resource-intensive animal tests. Moreover, in response to the worldwide trend to reduce animal testing, there is an acute need to develop novel, robust in vitro genetic toxicity tests. Currently available in vitro genetic toxicity assays are not always reliable. This is, in part, due to their limited ability to simulate mammalian metabolism, which is often critical for accurate assessment of chemical safety. This project involved the development of a novel, metabolically-competent in vitro genetic toxicity assay based on a well-validated mutation scoring system. More specifically, a gene mutation test was developed that employs liver cells (i.e., hepatocytes) isolated from the transgenic MutaMouse, a mouse strain wherein chemically-induced mutations can be easily quantified. The hepatocytes were grown in the laboratory and characterized to fully assess their utility for routine detection of chemically-induced mutations. Advanced microscopy was used to examine growth and morphological changes of the cultured hepatocytes. Further analysis showed that the cells are genetically stable. The isolated hepatocytes grow at a rate that is relevant to mutation scoring, and enzymes involved in mammalian metabolism were present and active. The results show that MutaMouse hepatocytes are well suited for in vitro assessment of genetic toxicity. The isolated hepatocytes behave like normal liver cells, are capable of metabolizing chemicals, and offer the reliable MutaMouse mutation scoring system. A companion manuscript employed a set of test chemicals to evaluate the performance of the assay.

dc.description.abstract - en

To develop an improved in vitro mammalian cell gene mutation assay, it is imperative to address the known deficiencies associated with existing assays. Primary hepatocytes isolated from the MutaMouse are ideal for an in vitro gene mutation assay due to their metabolic competence, their "normal" karyotype (i.e., neither transformed nor immortalized), and the presence of the MutaMouse transgene for rapid and reliable mutation scoring. The cells were extensively characterized to confirm their utility. Freshly isolated cells were found to have a hepatocyte-like morphology, predominantly consisting of binucleated cells. These cells maintain hepatocyte-specific markers for up to 3 days in culture. Analyses revealed a normal murine hepatocyte karyotype with a modal ploidy number of 4n. Fluorescence in situ hybridization analysis confirmed the presence of the lambda shuttle vector on chromosome 3. The doubling time was determined to be 22.5 ± 3.3 h. Gene expression and enzymatic activity of key Phase I and Phase II metabolic enzymes were maintained for at least 8 and 24 h in culture, respectively. Exposure to β-naphthoflavone led to approximately 900- and 9-fold increases in Cyp1a1 and Cyp1a2 gene expression, respectively, and approximately twofold induction in cytochrome P450 (CYP) 1A1/1A2 activity. Exposure to phenobarbital resulted in an approximately twofold increase in CYP 2B6 enzyme activity. Following this characterization, it is evident that MutaMouse primary hepatocytes have considerable promise for in vitro mutagenicity assessment. The performance of these cells in an in vitro gene mutation assay is assessed in Part II. Environ. Mol. Mutagen. 60:331-347, 2019.

dc.description.abstract-fosrctranslation - fr

Pour développer un test amélioré de mutation génétique des cellules de mammifères in vitro, il est impératif de remédier aux lacunes connues associées aux tests existants. Les hépatocytes primaires isolés de MutaMouse sont idéaux pour un test de mutation génique in vitro en raison de leur compétence métabolique, de leur caryotype « normal » (c'est-à-dire ni transformé ni immortalisé) et de la présence du transgène MutaMouse pour un score de mutation rapide et fiable. Les cellules ont été largement caractérisées pour confirmer leur utilité. Les cellules fraîchement isolées se sont révélées avoir une morphologie semblable à celle d’un hépatocyte, constituée principalement de cellules binucléées. Ces cellules conservent des marqueurs spécifiques des hépatocytes jusqu'à 3 jours en culture. Les analyses ont révélé un caryotype hépatocytaire murin normal avec un nombre de ploïdie modale de 4n. L'analyse d'hybridation in situ par fluorescence a confirmé la présence du vecteur navette lambda sur le chromosome 3. Le temps de doublement a été déterminé comme étant de 22,5 ± 3,3 h. L'expression des gènes et l'activité enzymatique des enzymes métaboliques clés de phase I et de phase II ont été maintenues pendant au moins 8 et 24 h en culture, respectivement. L'exposition à la β-naphtoflavone a entraîné une augmentation d'environ 900 et 9 fois de l'expression des gènes Cyp1a1 et Cyp1a2, respectivement, et une induction d'environ deux fois l'activité du cytochrome P450 (CYP) 1A1/1A2. L'exposition au phénobarbital a entraîné une multiplication par deux environ de l'activité enzymatique CYP 2B6. Suite à cette caractérisation, il est évident que les hépatocytes primaires MutaMouse sont très prometteurs pour l’évaluation de la mutagénicité in vitro. Les performances de ces cellules dans un test de mutation génique in vitro sont évaluées dans la partie II. Environ. Mol. Mutagène. 60 : 331-347, 2019.

dc.description.fosrctranslation - fr

Santé Canada est responsable de l'évaluation de la sécurité des produits chimiques commercialisés. toutes les évaluations comprennent une évaluation de la capacité d’une substance à endommager le matériel génétique (c’est-à-dire la toxicité génétique). Les tests de toxicité génétique utilisant des cellules cultivées (c'est-à-dire les tests in vitro) constituent une alternative rentable et rapide aux tests sur les animaux qui nécessitent davantage de ressources. De plus, en réponse à la tendance mondiale à réduire les tests sur les animaux, il existe un besoin urgent de développer de nouveaux tests de toxicité génétique in vitro robustes. Les tests de toxicité génétique in vitro actuellement disponibles ne sont pas toujours fiables. Cela est dû en partie à leur capacité limitée à simuler le métabolisme des mammifères, qui est souvent essentiel pour une évaluation précise de la sécurité chimique. Ce projet impliquait le développement d'un nouveau test de toxicité génétique in vitro, métaboliquement compétent, basé sur un système de notation des mutations bien validé. Plus précisément, un test de mutation génétique a été développé qui utilise des cellules hépatiques (c'est-à-dire des hépatocytes) isolées de la MutaMouse transgénique, une souche de souris dans laquelle les mutations induites chimiquement peuvent être facilement quantifiées. Les hépatocytes ont été cultivés en laboratoire et caractérisés pour évaluer pleinement leur utilité pour la détection de routine des mutations induites chimiquement. La microscopie avancée a été utilisée pour examiner la croissance et les changements morphologiques des hépatocytes en culture. Une analyse plus approfondie a montré que les cellules sont génétiquement stables. Les hépatocytes isolés se développent à un rythme pertinent pour l'évaluation des mutations, et les enzymes impliquées dans le métabolisme des mammifères étaient présentes et actives. Les résultats montrent que les hépatocytes MutaMouse sont bien adaptés à l’évaluation in vitro de la toxicité génétique. Les hépatocytes isolés se comportent comme des cellules hépatiques normales, sont capables de métaboliser des produits chimiques et offrent le système fiable de notation des mutations MutaMouse. Un manuscrit complémentaire utilisait un ensemble de produits chimiques de test pour évaluer les performances du test.

dc.identifier.doi

https://doi.org/10.1002/em.22253

dc.identifier.uri

https://open-science.canada.ca/handle/123456789/2207

dc.language.iso

en

dc.publisher

Wiley

dc.subject - en

Health

Health and safety

dc.subject - fr

Santé

Santé et sécurité

dc.subject.en - en

Health

Health and safety

dc.subject.fr - fr

Santé

Santé et sécurité

dc.title - en

The development and prevalidation of an in vitro mutagenicity assay based on MutaMouse primary hepatocytes, Part I: Isolation, structural, genetic, and biochemical characterization

dc.type - en

Article

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