Characterizing Benzo[a]pyrene-induced lacZ mutation spectrum in transgenic mice using next-generation sequencing

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dc.contributor.author

Beal, Marc A.

Gagné, Rémi

Williams, Andrew

Marchetti, Francesco

Yauk, Carole L.

dc.date.accessioned

2024-05-05T16:52:43Z

dc.date.available

2024-05-05T16:52:43Z

dc.date.issued

2015-10-19

dc.description - en

Health Canada helps to protect the health of Canadians by assessing and managing the health risks associated with chemical exposures. Exposures to certain chemicals can induce different types of DNA damage that can cause mutations, and these genetic alterations can potentially lead to the progression of diseases such as cancer. Therefore, it is important to characterize the types of mutations induced by chemicals in order to understand the mechanisms by which they may promote disease. For this reason, Health Canada developed a cost-effective and time-saving method to study the types of mutations induced by chemical exposure. The method uses a well-established genetically modified mouse strain (called Muta™Mouse) that is routinely used to determine the number of mutations induced following a particular exposure. With this improved method, mutations isolated with the Muta™Mouse test are subject to DNA sequence analysis using high-throughput next generation sequencing methodologies that allow the sequencing of tens of thousands of DNA sequences simultaneously. Proof of principle was demonstrated by sequencing the bone marrow DNA of mice exposed to benzo[a]pyrene (BaP), a known mutagenic carcinogen that induces predictable changes in DNA sequence. The results showed that this new method is much faster and more cost-effective than existing methods, and provides accurate information on the types of mutations that occur. It is envisioned that this method will be routinely used in the future to investigate the harmful effects of other chemicals and provide information on the mechanisms underlying toxicological effects.

dc.description.abstract - en

Background The transgenic rodent mutation reporter assay provides an efficient approach to identify mutagenic agents in vivo. A major advantage of this assay is that mutant reporter transgenes can be sequenced to provide information on the mode of action of a mutagen and to identify clonally expanded mutations. However, conventional DNA sequence analysis is laborious and expensive for long transgenes, such as lacZ (3096 bp), and is not normally implemented in routine screening. Methods We developed a high-throughput next-generation sequencing (NGS) approach to simultaneously sequence large numbers of barcoded mutant lacZ transgenes from different animals. We collected 3872 mutants derived from the bone marrow DNA of six Muta™Mouse males exposed to the well-established mutagen benzo[a]pyrene (BaP) and six solvent-exposed controls. Mutants within animal samples were pooled, barcoded, and then sequenced using NGS. Results We identified 1652 mutant sequences from 1006 independent mutations that underwent clonal expansion. This deep sequencing analysis of mutation spectrum demonstrated that BaP causes primarily guanine transversions (e.g. G:C → T:A), which is highly consistent with previous studies employing Sanger sequencing. Furthermore, we identified novel mutational hotspots in the lacZ transgene that were previously uncharacterized by Sanger sequencing. Deep sequencing also allowed for an unprecedented ability to correct for clonal expansion events, improving the sensitivity of the mutation reporter assay by 50 %. Conclusion These results demonstrate that the high-throughput nature and reduced costs offered by NGS provide a sensitive and fast approach for elucidating and comparing mutagenic mechanisms of various agents among tissues and enabling improved evaluation of genotoxins.

dc.description.abstract-fosrctranslation - fr

Arrière-plan Le test rapporteur de mutation de rongeur transgénique constitue une approche efficace pour identifier les agents mutagènes in vivo. Un avantage majeur de ce test est que les transgènes rapporteurs mutants peuvent être séquencés pour fournir des informations sur le mode d’action d’un mutagène et pour identifier les mutations clonées. Cependant, l’analyse conventionnelle des séquences d’ADN est laborieuse et coûteuse pour les transgènes longs, tels que lacZ (3 096 pb), et n’est normalement pas mise en œuvre dans le criblage de routine. Méthodes Nous avons développé une approche de séquençage de nouvelle génération (NGS) à haut débit pour séquencer simultanément un grand nombre de transgènes lacZ mutants codés par code-barres provenant de différents animaux. Nous avons collecté 3 872 mutants dérivés de l'ADN de la moelle osseuse de six mâles Muta™Mouse exposés au mutagène bien établi benzo[a]pyrène (BaP) et de six témoins exposés aux solvants. Les mutants présents dans les échantillons d'animaux ont été regroupés, codés par code-barres, puis séquencés à l'aide de NGS. Résultats Nous avons identifié 1 652 séquences mutantes provenant de 1 006 mutations indépendantes ayant subi une expansion clonale. Cette analyse de séquençage approfondie du spectre de mutation a démontré que le BaP provoque principalement des transversions de guanine (par exemple G: C → T: A), ce qui est tout à fait cohérent avec les études antérieures utilisant le séquençage de Sanger. De plus, nous avons identifié de nouveaux points chauds de mutation dans le transgène lacZ qui n'étaient auparavant pas caractérisés par le séquençage de Sanger. Le séquençage en profondeur a également permis une capacité sans précédent à corriger les événements d’expansion clonale, améliorant ainsi de 50 % la sensibilité du test du rapporteur de mutation. Conclusion Ces résultats démontrent que la nature à haut débit et les coûts réduits offerts par NGS fournissent une approche sensible et rapide pour élucider et comparer les mécanismes mutagènes de divers agents parmi les tissus et permettre une meilleure évaluation des génotoxines.

dc.description.fosrctranslation - fr

Santé Canada contribue à protéger la santé des Canadiens en évaluant et en gérant les risques pour la santé associés à l'exposition à des produits chimiques. L'exposition à certains produits chimiques peut induire différents types de dommages à l'ADN pouvant provoquer des mutations, et ces altérations génétiques peuvent potentiellement conduire à la progression de maladies telles que le cancer. Il est donc important de caractériser les types de mutations induites par les produits chimiques afin de comprendre les mécanismes par lesquels ils peuvent favoriser la maladie. Pour cette raison, Santé Canada a développé une méthode rentable et rapide pour étudier les types de mutations induites par l'exposition à des produits chimiques. La méthode utilise une souche de souris génétiquement modifiée bien établie (appelée Muta™Mouse) qui est couramment utilisée pour déterminer le nombre de mutations induites suite à une exposition particulière. Grâce à cette méthode améliorée, les mutations isolées avec le test Muta™Mouse sont soumises à une analyse de séquence d'ADN à l'aide de méthodologies de séquençage de nouvelle génération à haut débit qui permettent le séquençage simultané de dizaines de milliers de séquences d'ADN. La preuve de principe a été démontrée en séquençant l'ADN de la moelle osseuse de souris exposées au benzo[a]pyrène (BaP), un cancérogène mutagène connu qui induit des changements prévisibles dans la séquence d'ADN. Les résultats ont montré que cette nouvelle méthode est beaucoup plus rapide et plus rentable que les méthodes existantes et fournit des informations précises sur les types de mutations qui se produisent. Il est prévu que cette méthode soit utilisée systématiquement à l'avenir pour étudier les effets nocifs d'autres produits chimiques et fournir des informations sur les mécanismes sous-jacents aux effets toxicologiques.

dc.identifier.doi

https://doi.org/10.1186/s12864-015-2004-4

dc.identifier.uri

https://open-science.canada.ca/handle/123456789/2419

dc.language.iso

en

dc.publisher

BMC

dc.subject - en

Health

Health and safety

dc.subject - fr

Santé

Santé et sécurité

dc.subject.en - en

Health

Health and safety

dc.subject.fr - fr

Santé

Santé et sécurité

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Characterizing Benzo[a]pyrene-induced lacZ mutation spectrum in transgenic mice using next-generation sequencing

dc.type - en

Article

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